质子活化氯通道TMEM206的低温电子显微结构

的跨膜蛋白206简称为TMEM206是伏于遍在表达，质子活化，外向整流的进化上保守的氯离子通道阴离子电流。在现在发表在《科学进展》上的新报告中圣路易斯华盛顿大学医学院的Deng Zinqin Deng和一个多学科研究小组描述了河豚TMEM206的低温电子显微镜(cryo-EM)结构。该结构形成具有两个跨膜区段和大的细胞外结构域的三聚体通道。根据结果​​，邓等人。展示了如何从三个侧面入口侧向进入细胞外区域的充足前庭，其中三个孔包含多个结构。例如，靠近内螺旋的细胞质区域的保守的赖氨酸残基大概形成了氯离子选择性过滤器。核心结构和组装类似于钠通道，在氨基酸序列上不相关，因此传导阳离子而不是阴离子。

氯离子通道

氯离子是动物中丰富的阴离子，它们通过氯离子通道和转运蛋白在细胞膜上移动，以实现多种细胞功能，包括细胞体积调节，细胞内酸化和肌肉兴奋性控制。尽管到目前为止，氯离子流背后的分子成分仍然难以捉摸，但在哺乳动物细胞中已广泛观察到离子。两项使用全基因组RNA干扰筛选的独立研究已将TMEM206确定为潜在的阴离子通道。TMEM206在脊椎动物中是进化保守的。氯离子通道在氨基酸序列和三维结构上都各不相同。在这项工作中，邓等人。提出了河豚鱼TMEM206的低温电子显微镜(cryo-EM)结构揭示了与以前已知的三聚体通道结构不同的结构。科学家将电生理学与这项工作相结合，为进化上保守且广泛表达的氯离子通道提供了第一个结构和功能描述，以建立分子框架并了解氯离子的传导和通道门控。

研究人员使用带有绿色荧光蛋白标签的构建体来识别TMEM206候选物，并选择了河豚鱼TMEM206，因为它们与人类氯离子通道具有50%的共享序列同一性。邓等。然后纯化全长野生型河豚TMEM206蛋白，并对其进行单颗粒冰冻EM分析。他们使用3D重建图揭示了具有跨膜和膜外结构域的三聚体通道结构。TMEM206形成了一个对称的三聚体，其中每个亚基都包含一个跨膜结构域(TMD)具有两个名为TM1和TM2的跨膜螺旋，以及一个富含β结构域的大细胞外结构域(ECD)，该结构域在上层和下层中还组织有其他基序。另外，广泛的侧链接触通过内部和外部β结构域中的范德华相互作用而参与。三聚体通道组件在细胞外区域的中间引入了三个侧向开口或侧向入口，可能有助于离子和水的通过。细长的侧门延伸到ECD-TMD连接处，以恢复紧密的包装相互作用。为了克服确定蛋白质结构的任何技术难题，Deng等人。融合了骨限制干扰素诱导的跨膜样蛋白的C端(BRIL的缩写);一种四螺旋束蛋白，广泛用作结晶伴侣，以改善膜的稳定性并促进晶体形成。

离子渗透途径和诱变研究

使用孔半径计算，邓等。显示了中心离子传导孔如何包含多个收缩区域以防止离子通过。由于用于确定cryo-EM结构的高pH缓冲液条件(pH 8.0)，该结构表示非导电构象。由于在细胞外结构域中缺乏蛋白质-蛋白质接触，因此可以从侧面进入庞大而细长的前庭。蛋白质通道的窄点不会干扰离子传导，并且可以在通道门控周期中随着离子穿过三个侧面入口而得以维持。前庭和侧面入口的内壁略带正电，也促进了氯离子的吸引。在细胞外结构域-跨膜结构域(ECD-TMD)交界处，三股线连接到外部螺旋，并向内移动以连接内部螺旋，以在胆汁层上方生成细胞外门。在面向孔的位置上的连续结构形成了疏水门，该疏水门可能会阻止离子传导。

为了支持结构发现，邓等人。对主要的孔活性残基进行了诱变研究。当他们用丙氨酸或酸性残基取代保守的碱性残基时，酸活化的氯离子电流被消除。相反，精氨酸取代保留了通道功能，以进一步支持阴离子选择性过滤器中正电荷的需求。例如，I310域形成了跨膜门的关键组件，而另一种称为K320的结构则形成了阴离子选择性过滤器。这项工作支持人类与河豚直系同源物之间的结构保守，以代表氯离子通道的生理相关模型。

结构趋同

TMEM206的拓扑，结构和组装代表了离子通道(包括酸敏感离子通道(ASIC))的上皮钠通道(ENaC)/去氢蛋白超家族的拓扑，结构和组装。尽管两个通道之间缺乏独特的氨基酸序列同源性。然而，带相反电荷的钠和氯离子的三聚体通道共有一个共同的核心结构，两侧是两个跨膜螺旋。研究小组指出，通道激活后，前庭和跨膜孔之间的细胞外门如何扩展以使离子通过。虽然上皮钠通道可以通过在细胞外域中通过蛋白水解释放抑制性肽来激活，但ASIC和TMEM206只能是被细胞外质子激活。TMEM和AS1CS之间保守的结构特征也暗示了这两种分子的类似门控构象变化。

外表

这样，Zengqin Deng及其同事就使用了单粒子冷冻EM来确定通常使用传统X射线晶体学无法获得的完整膜蛋白的结构。由于低的对比度和信噪比，对于小尺寸的膜蛋白实现近原子分辨率仍然是一项重大的技术挑战。邓等。通过融合小的结晶分子伴侣BRIL来提高通道的3.5埃分辨率结构，从而提高了次优膜蛋白的稳定性，从而促进了晶体堆积。基于保守的核结构，通道对阳离子或阴离子具有选择性，并经历类似的门控构象变化。这项工作建立了新的一类氯离子通道，从而为细胞和结构生物学的进一步功能和机械研究形成了新的框架。

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